Anti Thyroid Peroxidase Elisa ชุดทดสอบ Anti TPO Antibody Test Kits

Anti-TPO Anti-Thyroid Peroxidase Elisa Kit

1. วัตถุประสงค์การใช้งาน

การทดสอบภูมิคุ้มกันสำหรับการกำหนดปริมาณแอนติบอดีต่อไทรอยด์เปอร์ออกซิเดสในซีรัมของมนุษย์ในหลอดทดลองการกำหนด anti-TPO ใช้เพื่อช่วยในการวินิจฉัยโรคต่อมไทรอยด์ autoimmune

2. สรุป 

• เปอร์ออกซิเดสจำเพาะต่อมไทรอยด์ (TPO) มีอยู่ในไมโครโซมของไทโรไซต์และแสดงออกที่ผิวเซลล์ปลายในการทำงานร่วมกับไทโรโกลบูลิน (Tg) เอ็นไซม์นี้มีหน้าที่สำคัญในการสร้างไอโอดีนของแอล-ไทโรซีนและการมีเพศสัมพันธ์ทางเคมีของโมโน- และได-ไอโอโดไทโรซีนที่เป็นผลให้เกิดฮอร์โมนไทรอยด์ T4, T3 และ fT3
• TPO เป็น autoantigen ที่มีศักยภาพระดับของแอนติบอดีในซีรั่มที่เพิ่มขึ้นต่อ TPO พบได้ใน ไทรอยด์อักเสบหลายรูปแบบที่เกิดจากภูมิต้านทานผิดปกติคำว่า “ไมโครโซมอลแอนติบอดี” ที่ยังคงพบบ่อยมีต้นกำเนิดมาจากเวลาที่ยังไม่ระบุ TPO เป็นแอนติเจนในภูมิต้านทานผิดปกติที่เกิดจากไมโครโซมในแง่ทางคลินิก สามารถใช้แอนติบอดีต่อต้าน TPO และ microsomal สองคำมีความหมายเหมือนกันอย่างไรก็ตามมีความแตกต่างกันเกี่ยวกับวิธีการทดสอบ
• ไทรอยด์ที่ต้าน TPO สูงพบได้ในผู้ป่วยที่มีไทรอยด์อักเสบเรื้อรังของ Hashimoto ถึง 90%ในโรค Graves' 70% ของผู้ป่วยมีระดับไทเทอร์สูงแม้ว่าความไวของขั้นตอนจะเพิ่มขึ้นโดยการระบุไทรอยด์แอนติบอดีอื่นๆ พร้อมกัน (anti-Tg, TSH-receptor-antibody - TRAb) การค้นพบเชิงลบไม่ได้ตัดทอนความเป็นไปได้ที่จะเป็นโรคภูมิต้านตนเองขนาดของแอนติบอดี titer ไม่มีความสัมพันธ์กับกิจกรรมทางคลินิกของโรคค่า titers ที่สูงขึ้นในขั้นต้นอาจกลายเป็นลบได้หลังจากเจ็บป่วยเป็นระยะเวลานานหรือระหว่างการให้อภัยหากแอนติบอดีปรากฏขึ้นอีกครั้งหลังจากการให้อภัย การกำเริบของโรคอาจเป็นไปได้
• ในขณะที่การทดสอบไมโครโซมอลแอนติบอดีตามปกติใช้ไมโครโซมที่ไม่บริสุทธิ์เพื่อเตรียมแอนติเจน การทดสอบต้าน TPO ใช้เปอร์ออกซิเดสที่ทำให้บริสุทธิ์ขั้นตอนทั้งสองมีประสิทธิภาพเทียบเท่ากันในแง่ของความไวทางคลินิก แต่ความสม่ำเสมอของล็อตต่อล็อตที่ดีขึ้นและความจำเพาะทางคลินิกที่สูงขึ้นสามารถคาดหวังได้จากการทดสอบต้าน TPO เนื่องจากคุณภาพของแอนติเจนที่ใช้สูงขึ้นการทดสอบด้วยเอนไซม์ที่เชื่อมโยง immunosorbent ใช้แอนติเจนของมนุษย์และ แอนติบอดีต่อต้าน IgG ของมนุษย์สำหรับกระต่าย (anti-IgG)

3. หลักการทดสอบ

วิธีทางอ้อม ระยะเวลาการทดสอบทั้งหมด: 70 นาที

Anti-TPO ELISA ใช้วิธี ELISA ทางอ้อมแบบโซลิดเฟสสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อ TPO ในกระบวนการฟักไข่แบบสองขั้นตอนแถบไมโครเวลล์โพลีสไตรีนถูกเคลือบไว้ล่วงหน้าด้วยแอนติเจน TPO ของมนุษย์ที่มีภูมิคุ้มกันสูงในระหว่างขั้นตอนการฟักไข่ครั้งแรก แอนติบอดีที่จำเพาะต่อ TPO หากมี จะถูกจับกับแอนติเจน TPO ที่เคลือบล่วงหน้าด้วยเฟสของแข็งบ่อน้ำจะถูกล้างเพื่อขจัดโปรตีนในซีรัมที่ไม่ถูกผูกไว้ และแอนติบอดีต่อต้าน IgG ของมนุษย์ (anti-IgG) ของกระต่ายที่ถูกคอนจูเกตกับเอนไซม์ฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP- Conjugate) จะถูกเพิ่มเข้าไปในระหว่างขั้นตอนการฟักไข่ที่สอง แอนติบอดีที่ควบกับ HRP เหล่านี้จะถูกจับกับสารเชิงซ้อนของแอนติเจน-แอนติบอดี (IgG) ใดๆ ที่ก่อรูปขึ้นก่อนหน้านี้และคอนจูเกต HRP ที่ไม่ถูกผูกจากนั้นถูกกำจัดออกโดยการล้างสารละลายโครโมเจนที่ประกอบด้วยเตตระเมทิลเบนซิดีน (TMB) และยูเรียเปอร์ออกไซด์จะถูกเติมลงในบ่อน้ำและเมื่อมีอิมมูโนคอมเพล็กซ์แอนติเจน-แอนติบอดี-ต่อต้าน IgG (HRP) อยู่ โครโมเจนที่ไม่มีสีจะถูกไฮโดรไลซ์โดยคอนจูเกต HRP ที่ผูกไว้กับผลิตภัณฑ์สีน้ำเงินสีฟ้าจะเปลี่ยนเป็นสีเหลืองหลังจากหยุดปฏิกิริยากับกรดซัลฟิวริก

ปริมาณของความเข้มของสีสามารถวัดได้และเป็นสัดส่วนกับปริมาณของแอนติบอดีที่จับได้ในหลุม และปริมาณของแอนติบอดีในตัวอย่างตามลำดับ

4. วัสดุรีเอเจนต์ที่ให้มา

• ไมโครเพลทเคลือบ 8 x 12 แผ่น 96 หลุมเคลือบล่วงหน้าด้วยแอนติเจน TPO ของมนุษย์

• เครื่องสอบเทียบ 6 ขวด ขวดละ 1 มล. พร้อมใช้ความเข้มข้น: 0(A), 25(B) ,50(C), 100(D), 250(E) และ 500(F) IU/มล.

• Enzyme Conjugate, 1 vial, 11.0 mL of HRP (horseradish peroxidase) แอนติบอดีต่อต้าน IgG ของมนุษย์ที่ติดฉลากกระต่าย (anti-IgG) ในบัฟเฟอร์ Tris-NaCl ที่มี BSA (bovine serum albumin)ประกอบด้วยสารกันบูด ProClin300 0.1%

• Serum Diluent: 1 ขวด 11มล.ที่ประกอบด้วยเกลือบัฟเฟอร์และสีย้อม

• Wash Solution Concentrate, 1 ขวด, 25 ml (เข้มข้น 40X), PBS-Tween wash solution.

• Substrate, 1 vial, 11ml, พร้อมใช้, (tetramethylbenzidine) TMB.

• Stop Solution, 1 vial, 6.0 ml of 1 mol/l sulfuric acid.

• IFU จำนวน 1 ชุด

• ฝาจาน: 2 ชิ้น.

วัสดุที่จำเป็น (แต่ไม่ได้ให้มา)

• เครื่องอ่านไมโครเพลทพร้อมความสามารถในการดูดซับความยาวคลื่น 450nm และ 620nm

• เครื่องซักผ้าไมโครเพลท

• ตู้ฟัก.

• เครื่องปั่นจาน.

• ไมโครปิเปตและไมโครปิเปตแบบหลายช่องสัญญาณที่มีขนาด 50µl ด้วยความแม่นยำที่ดีกว่า 1.5%

• กระดาษดูดซับ

• น้ำกลั่น

5. ขั้นตอนการทดสอบ

• ใช้เฉพาะจำนวนหลุมที่ต้องการและจัดรูปแบบหลุมไมโครเพลทสำหรับเครื่องสอบเทียบและตัวอย่างแต่ละตัวที่จะวิเคราะห์

• เพิ่มเครื่องสอบเทียบขนาด 100 µL ในแต่ละหลุม

• เพิ่ม 100 µL ของ Sample Diluent (สีเขียว) ให้กับแต่ละหลุม ยกเว้น Calibrator-wells

• เพิ่มตัวอย่าง 10 µL ลงในแต่ละหลุมของตัวอย่างเจือจาง (หมายเหตุ: รีเอเจนต์ใน Wells จะเปลี่ยนเป็นสีน้ำเงินจากสีเขียว) จากนั้นเขย่า 30 วินาที

• ปิดฝาจานและฟักที่อุณหภูมิ 37 °C เป็นเวลา 30 นาที

• ทิ้งเนื้อหาของไมโครเพลทโดยการแยกส่วนหรือความทะเยอทะยานหากกำลังเท ให้แตะและเช็ดจานให้แห้งด้วยกระดาษซับน้ำ

• เติมน้ำยาล้าง 350 ไมโครลิตร เท (ก๊อกและซับ) หรือสำลักทำซ้ำอีก 4 ครั้ง รวมเป็น 5 ครั้งเมื่อสิ้นสุดการซัก ให้พลิกจานและเคาะน้ำยาล้างที่เหลือลงบนกระดาษซับน้ำ

• เพิ่ม 100 ไมโครลิตรของคอนจูเกตของเอนไซม์

• ปิดฝาจานและฟักที่อุณหภูมิ 37 °C เป็นเวลา 30 นาที

• เติมน้ำยาล้าง 350 ไมโครลิตร เท (ก๊อกและซับ) หรือสำลักทำซ้ำอีก 4 ครั้ง รวมเป็น 5 ครั้งเมื่อสิ้นสุดการซัก ให้พลิกจานและเคาะน้ำยาล้างที่เหลือลงบนกระดาษซับน้ำ

• เพิ่มสารตั้งต้น 100 µL ในแต่ละหลุมปิดฝาและฟักที่อุณหภูมิแวดล้อม (18-25 ℃) ในที่มืดเพื่อทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 10 นาทีอย่าเขย่าจานหลังจากเติมสารย่อย

• เติมสารละลายสต็อป 50 ไมโครลิตรต่อหลุม

• เขย่าประมาณ 15-20 วินาที เพื่อผสมของเหลวภายในบ่อสิ่งสำคัญคือต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าสีน้ำเงินเปลี่ยนเป็นสีเหลืองอย่างสมบูรณ์

• อ่านค่าการดูดกลืนแสงของแต่ละหลุมที่ 450 นาโนเมตร (โดยใช้ความยาวคลื่นอ้างอิง 620 ถึง 630 นาโนเมตรเพื่อลดความไม่สมบูรณ์ของหลุม) ในเครื่องอ่านไมโครเพลตควรอ่านผลลัพธ์ภายใน 30 นาทีหลังจากเพิ่มสารละลายหยุด